探究宿主-病原體相互作用特點是研究微生物與免疫學方向學科的重要方法。宿主細胞吞噬病原體后其表征將會改變，多數研究主要利用宿主細胞或者細胞系在體外實現，說明RNA的表達或細胞培養中回收的蛋白質的情況。實驗條件下，所有的宿主細胞擁有相同數量病原體具有合理性。然而，利用吞噬細胞的病原體吸收是不同步的。所以，包含了不同數量病原體的宿主細胞導致不同致病菌誘導的蛋白質生物合成。

本實驗應用免疫熒光標記分析方法檢測與宿主細胞相關的病原體的數量。結合多marker染色，分析宿主細胞種群的感染情況和寄生負荷結果（相關宿主細胞的表型）。隨著單克隆抗體和熒光標記試劑的產生，宿主細胞在進程中的變異研究增多。

事實上，已有實驗利用多通道流式細胞術和熒光顯微技術來檢測寄生蟲與宿主細胞關系，但兩種方法均有不足。流式細胞分析術（FACS）能夠檢測擁有寄生蟲的宿主細胞的表型，但不能精確到單細胞中寄生蟲的數量且不能做到細胞原位的定位。熒光顯微技術的準確性更高，原位表面marker的表達情況能夠篩選擁有寄生蟲的宿主細胞。但是，宿主細胞寄生負荷marker強度的高度客觀仍然存在困難。

因此，一種能夠將單細胞定量和宿主細胞表型分析相結合的技術是十分必要的。

實驗方法

利用TissueQuest和StrataQuest軟件同時滿足單細胞定量分析和宿主細胞表型分析。以Dot-Finder運算法為核心的全景組織細胞定量分析技術，分析感染了L.major的原位及體外巨噬細胞。

與流式細胞術（FACS）相比，熒光標記marker的強度能夠在原位單細胞級別定量且不需要制備細胞懸浮液。TissueQuest軟件能夠實現從實驗數據精確反向回溯到影像中的細胞。反向回溯的特征可以用來檢測原位細胞亞群，設門的細胞定位(DAPI，AF546（CD11b）和Cy5(F4/80)。通過調節核的尺寸，面積和灰度值完成軟件分析。反向回溯實時觀察創建的陽性細胞散點圖。根據細胞尺寸和染色強度確定cut-off值。檢測DAPI的陽性值和細胞中活性L.major，利用ring mask功能創建DAPI通道。

實驗數據

淋巴腺體部分的胞內病原體檢測

細胞核識別和ring mask計算

單通道影像獲取，利用四通道進行熒光檢(DAPI,FITC,Rhodamin,Cy5),每個影像包含將近50-200個細胞，并且掃描部分圖像自動拼接。每個熒光通道的影像和多個FOV都能夠被自動獲取，收集和后期的組合。(A) 利用參數調節識別細胞核(B) 創建ring mask (C) ring mask中黃色高亮部分為自動篩選ROI中病原體

Ring mask中的L.major病原體識別

根據活性病原體的微弱信號和復雜的背景信息識別病原體

Parasite finder預設程序可根據用戶需要選擇方法最高程度的區別背景與待分析部分。

(A) ring mask胞質部分，代表缺少病原體培養的條件下的巨噬細胞。(B) 藍色部分為感染的巨噬細胞的ring mask,黃色箭頭標出DAPI的陽性信號。(C) 黃色部分微弱信號區分未感染的巨噬細胞的ring mask中的偽信號。（D）創建偽陽性信號。多于30個病原體的巨噬細胞被標出。（E）檢測微弱信號區分沒有被感染的巨噬細胞的ring mask中的非偽信號。（F）所有被感染的巨噬細胞（黃色部分和黃色箭頭）均被識別出。

感染的巨噬細胞病原體密度和感染比例

（A）軟件自動計算感染與未感染的巨噬細胞。（B）每個巨噬細胞胞內寄生蟲的平均數量的定量分析。在分析了237個與8639個細胞后，得出隨即選擇的樣本足以證明總感染比例的正確性。（C）胞內寄生蟲與巨噬細胞的關系。胞內病原體的數量和Y軸相應的病原體對應的巨噬細胞擁有病原體的數量區間。

此圖闡明巨噬細胞中的活病原體的高度混雜性。推測原因為多樣化的吞噬作用和病原體繁殖的加強。巨噬細胞的表型決定胞內病原體擴張存在可能性。

感染與未感染的原位巨噬細胞定量分析骨髓細胞marker表達

(A) 直方圖表示X軸巨噬細胞擁有病原體與Y軸病原體的數量。分析得到細胞核，ring mask，ring mask中的病原體，ring mask中的CD11b或者F4/80的強度表達(B) 擁有不同數量病原體的巨噬細胞的平均強度分析。估算每個成核原位宿主細胞。

體外原位成活與失活胞內病原體的診斷

體外活細胞和死細胞的定量分析

失活病原體不能夠標記DAPI，所以軟件能夠識別宿主細胞中不同的病原體。對樣本進行EB-AO平行染色。StrataQuest識別細胞的胞質（綠色），細胞與細胞接觸部分（橘色）。

(A) AO灰階圖用于薄膜的檢測（綠色），細胞邊緣的確定（橘色）。(B) 對粘連細胞進行詳細分析。(C) 反向回溯確定巨噬細胞擁有多于2個失活寄生蟲。(E) 擁有失活寄生蟲的巨噬細胞的頻率分析。（F）擁有不同數量失活寄生蟲的吞噬細胞的頻率分析。

此圖為寄生負載的評估。(A) 被感染的淋巴腺, 灰階圖為DAPI+宿主細胞核和寄生蟲DNA。(B) 胞核，胞漿和寄生蟲的重疊影像(C)(D) 反向回溯擁有3和5-10寄生蟲的細胞(E)感染細胞的寄生負載。

DAPI的信號識別病原體的DNA并未退化，活檢，干燥前的病原體仍然具有活性。識別胞核（橘色）和核膜（綠色）。DAPI陽性病原能夠在宿主細胞的胞漿部分進行識別。

后續研究中會在宿主-寄生蟲的聯系的分子反應機理，微生物方向疾病治愈做出提高。