近期，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員利用TissueFAXS Cytometry系統(tǒng)完成免疫細(xì)胞原位表征的定性定量分析的文章，成功刊登在澳洲生物學(xué)網(wǎng)站News Medical上并且迅速登上Google搜索第一名的位置。

如今，由于單細(xì)胞成像和定量分析技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們已經(jīng)可以做到在組織原位中檢測(cè)免疫細(xì)胞。 但是，基于傳統(tǒng)熒光成像的顯微觀測(cè)技術(shù)受限于可見(jiàn)光光譜范圍，通常只能同時(shí)標(biāo)記、檢測(cè)四種生物標(biāo)志物，從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)，我們對(duì)于細(xì)胞狀態(tài)的理解仍然不全面。

借助于流式細(xì)胞術(shù)，人們可以在液流中同時(shí)檢查多個(gè)染色的生物標(biāo)志物，但它也會(huì)丟失細(xì)胞原始的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以及與其組織有關(guān)的微環(huán)境信息（tissue microenvironment）。

因此，建立一種既可以提供多細(xì)胞生物標(biāo)志物的數(shù)據(jù)信息，同時(shí)又保留組織細(xì)胞微環(huán)境信息的技術(shù)（就像常規(guī)顯微鏡一樣），在滿(mǎn)足當(dāng)代臨床科研的嚴(yán)格要求方面，將具有很大優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)概述

實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)自Marcus Bosenberg博士開(kāi)發(fā)的黑色素瘤小鼠模型中脾臟的組織樣本，由本文作者Kim Blenman博士分離出小鼠脾臟。Blenman使用福爾馬林固定石蠟包埋的脾臟組織切片，利用Cy3和Cy5染料染色，并進(jìn)行了熒光顯微成像觀察。Blenman主要關(guān)注點(diǎn)在于CD4跨膜蛋白（多種T細(xì)胞亞型的生物標(biāo)記物）以及六種其他細(xì)胞活性的標(biāo)志物——包含與這些細(xì)胞相關(guān)的增殖和轉(zhuǎn)錄功能。

本實(shí)驗(yàn)利用了多輪染色技術(shù)，在每一輪染色之間，使染料失活，這樣可以獲得細(xì)胞上的不同生物標(biāo)志物的染色情況，例如Foxp3，Granzyme B，IL-6，Ki-67，RORγ（t）和T-bet。

 Blenman博士所做的這種多輪染色技術(shù)，其實(shí)是TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry全景組織細(xì)胞定量分析技術(shù)一個(gè)應(yīng)用分支。利用該技術(shù)，不但可以獲得每輪染色的高倍率全景圖像，更重要的是可以把每輪染色圖像進(jìn)行擬合，獲得組織原位單細(xì)胞多重染色標(biāo)記的圖像后，再利用StrataQuest軟件分析。

該技術(shù)首先利用一種算法將拼接好的全景圖像擬合在一起，從而重新創(chuàng)建一個(gè)合成圖像，包含每輪染色回合中的單個(gè)細(xì)胞每個(gè)通道的生物標(biāo)記信息。在每個(gè)通道的單細(xì)胞識(shí)別層面，StrataQuest軟件生成的虛擬影像中，采用兩種不同的模式進(jìn)行識(shí)別：一種用來(lái)識(shí)別細(xì)胞核，另外一種用于鑒定細(xì)胞表型的生物標(biāo)記。隨后，通過(guò)確定目的蛋白的陽(yáng)性率，最終而完成整個(gè)定量分析。

在定量分析過(guò)程，使用的是“Backgating”反向回溯功能。根據(jù)原始圖像中信號(hào)表達(dá)的微小差異，精準(zhǔn)確定cutoff線(xiàn)閾值的設(shè)置位置，進(jìn)而區(qū)分陰陽(yáng)性細(xì)胞。類(lèi)似于流式細(xì)胞技術(shù)中從直方圖或散點(diǎn)圖中“gating”設(shè)門(mén)圈選功能，但是可以做到反向“gating”在原始圖像中實(shí)時(shí)校驗(yàn)圈選的范圍與結(jié)果。

Blenman博士將其用于脾臟組織樣本，證實(shí)一次就可以在組織原位單細(xì)胞水平獲得多種生物標(biāo)志物信息。根據(jù)細(xì)胞個(gè)體和簇表達(dá)的生物標(biāo)志物的不同組合，將這些細(xì)胞歸類(lèi)。通過(guò)這種方式，Blenman團(tuán)隊(duì)證明了細(xì)胞簇中CD4表達(dá)的水平與生物標(biāo)志物表達(dá)的模式、細(xì)胞增殖之間的關(guān)聯(lián)。

預(yù)見(jiàn)未來(lái)

免疫系統(tǒng)是異常復(fù)雜的，傳統(tǒng)熒光顯微成像針對(duì)每個(gè)細(xì)胞只能分析四種生物標(biāo)志物，對(duì)于免疫方向的研究是一個(gè)極大的限制。而TissueFAXS Cytometry的多輪多重染色標(biāo)記技術(shù)，以常規(guī)顯微成像為基礎(chǔ)，不但可以使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)染料，染色技術(shù)也無(wú)需特殊培訓(xùn)，非常易于使用。盡管本文作者此次分析了6種生物標(biāo)志物，但理論上講，同時(shí)分析生物標(biāo)記物的數(shù)量是沒(méi)有限制的。

Blenman博士指出，這種方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠在單細(xì)胞水平多標(biāo)記、客觀地量化細(xì)胞生物標(biāo)志物。因?yàn)獒槍?duì)個(gè)體疾病及其潛在機(jī)制的靶向治療的數(shù)量有所增加，該方法在癌癥治療中也是非常有效的（ Cytometry Part A）。

該方法具備流式細(xì)胞術(shù)的設(shè)門(mén)圈選功能，但額外提供反向回溯和散點(diǎn)圖直方圖數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式的功能，同時(shí)又可以保留空間位置信息。

TissueGnostics的創(chuàng)新

Blenman博士應(yīng)用TissueGnostics公司TissueFAXSCytometry技術(shù)，成功將文章發(fā)表在Cytometry Part A 雜志上。該技術(shù)兼顧高效，高自動(dòng)化的工作流程，同時(shí)可以與MATLAB腳本整合。此外，還可提供50多個(gè)針對(duì)特定研究方向的APP（數(shù)量還在不斷增加）。 每個(gè)APP都可以提供完善的分析工作流程，并提供多種數(shù)據(jù)報(bào)告形式。

TissueFAXS Plus是一款高兼容性的正置系統(tǒng)，能夠掃描和分析細(xì)胞涂片，玻片，涂片和TMA樣本。除常規(guī)配置外，支持多種形式定制（共聚焦/多光譜/高通量/全自動(dòng)顯微工作站等）。

同時(shí)可選配以下三個(gè)軟件之一，HistoQuest，TissueQuest和StrataQuest。StrataQuest是其中的分析軟件。StrataQuest可以自動(dòng)識(shí)別特定組織結(jié)構(gòu)（例如血管/神經(jīng)/腺體/腫瘤等），并可以識(shí)別和定量細(xì)胞樣本中的所有個(gè)單細(xì)胞。取決于全景虛擬切片的大小，一個(gè)樣本中可以定量分析的單個(gè)細(xì)胞數(shù)量，在數(shù)萬(wàn)個(gè)到數(shù)千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞不等，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他單細(xì)胞定量分析系統(tǒng)。

References

Blenman KRM &Bosenberg MW. Immune Cell and Cell Cluster Phenotyping, Quantitation, andVisualization Using In Silico Multiplexed Images and Tissue Cytometry.Cytometry A. 2019; 95:399-410. doi: 10.1002/cyto.a.23668.

News Medical(2018). Image Cytometry Technology and Tissue Analysis. Available at:https://www.news-medical.net/news/20180904/Image-Cytometry-Technology-and-Tissue-Analysis.aspx.Accessed: Aug 2019.